Normalizaci贸n de la dosis letal 50 % de cepas de Leptospira interrogans utilizadas en el control de la vacuna antileptospir贸sica cubana para uso humano

[摘要] Se normalizó la DL50 de las cepas de Leptospira interrogans utilizadas en el ensayo de potencia de la vacuna antileptospirósica trivalente cubana para uso humano. Se introdujo en la metodología el control del contenido de leptospiras de los cultivos mediante dilución de ajuste (10 a 12 leptospiras por campo). Ésta fue la clave de la normalización del ensayo, por garantizar la reproducibilidad del valor estimado de DL50 de cada serogrupo: 105,98 para canicola, 105,60 para icterohaemorrhagiae y 106,49 para pomona, con límites de 1 log10 de 104,98 - 106,9; 104,60- 106,60 y 105,49 -107,49 respectivamente, y para un intervalo de confianza de 95 % (±2 DE) fueron 105,54 - 106,19; 105,33 - 105,75 y 106,35 - 106,60 respectivamente, que son inferiores a los anteriores, lo que implica aún mayor reproducibilidad. La metodología descrita fue satisfactoria en la normalización de la DL50 de las cepas de reto y podría ser utilizada también en la evaluación de la virulencia de otras cepas de L.interrogans, incluidas las de producción de la vacuna.Descriptores DeCs: DOSIFICACION LETAL MEDIANA; LEPTOSPIRA INTERROGANS/inmunología; LEPTOSPIRA INTERROGANS/aislamiento & purificación; VACUNAS BACTERIANAS; CUBA.La leptospirosis es una enfermedad de amplia difusión en todo el mundo. Su agente causal es Leptospira interrogans, se reportan más de 50 especies animales que sirven de reservorio a este microorganismo (roedores, insectívoros, carnívoros, primates, ranas, serpientes, lagartos, peces, etcetéra), por lo que se encuentra en constante circulación en el entorno natural e infectan a los animales domésticos y al hombre. Desde el punto de vista epidemiológico la leptospirosis se considera una zoonosis. El agua contaminada es uno de los factores que más contribuyen a su diseminación.1,2Las medidas de prevención son múltiples y entre ellas se destacan el control de roedores, la higiene del medio ambiente, y la vacunación de animales y personas con alto riesgo de padecer la leptospirosis.2-5Las vacunas utilizadas para estos fines se controlan en el laboratorio durante su proceso de producción mediante diferentes ensayos. Uno de ellos es el de potencia, el cual mide la protección que confiere el producto a animales inmunizados que reciben una dosis conocida de leptosopiras virulentas, la cual se expresa cuantitativamente y su unidad de medida es la dosis letal 50 % (DL50). Este término es muy utilizado para expresar la magnitud de la virulencia de microorganismos (virus, bacterias) y la toxicidad de sustancias sintetizadas por éstos. Se define en general como la menor cantidad de gérmenes virulento o de toxina que al administrarse por la vía apropiada a un número de animales susceptibles, provoca la muerte de la mitad de éstos (50 %) al término de un período dado.En la producción de vacunas, las dosis de reto o de confrontación de los animales inmunizados correspondientes al ensayo de potencia se refieren siempre en términos de DL50.6-10 Ésta a su vez se puede expresar de diferentes maneras: como gérmenes por dosis, títulos, dilución, unidades arbitrarias, unidades de masa o volumen (en el caso de toxinas), etcétera.En relación con la vacuna antileptospirósica, las cepas usadas en la producción deben mantener altos niveles de virulencia para lograr un preparado de calidad; este parámetro se controla mediante la evaluación de la DL50 , al igual que en las cepas destinadas al ensayo de potencia, donde se necesita además que el valor estimado sea reproducible para garantizar dosis de confrontación que contengan de 10 a 10 000 DL50, como se especifica en algunos documentos regulatorios.9,10La Dl50 de L. interrogans, al igual que para otras bacterias y virus, se determina mediante un ensayo biológico consistente en inocular diluciones seriadas (generalmente con factor igual a 10)preparadas a partir de una suspensión virulenta del microorganismo, las cuales se inoculan en hámsters u otros animales de laboratorio que sean susceptibles. Este ensayo es muy específico, pero está sometido a grandes variaciones debidas sobre todo a la naturaleza biológica de sus componentes fundamentales: animales y microorganismos.Por estas 2 razones es muy importante, cuando se define la DL50 de un germen determinado, fijar todos los parámetros posibles bajo los cuales se desarrolla satisfactoriamente el ensayo, para que los valores calculados sean reproducibles y, por tanto, útiles para los fines a los que están destinados. El primer parámetro que se debe controlar es la conservación de la virulencia de las cepas. La liofilización es una forma muy usada para estos fines, sobre todo si se trata de microorganismos que intervienen en la producción y el control de vacunas por sus múltiples ventajas, entre ellas, la facilidad de almacenamiento a largo plazo en condiciones normales de refrigeración (2 a 8EC) y la garantía de la integridad de las cepas al utilizar el sistema de lotes semilla recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS),11 que implica reproducibilidad en los procesos y ensayos donde sean utilizadas las cepas.L. interrogans pierde con facilidad su virulencia cuando se somete a pases repetidos por medios de cultivo; la liofilización no ha sido la forma más exitosa para su conservación,12 lo cual limita la posibilidad de aplicar correctamente el sistema de lotes semilla. El mantenimiento en nitrógeno líquido ha mostrado ser apropiado,13 pero resulta costoso y limitado. El uso de medios semisólidos es frecuente, aunque tiene el inconveniente de que no conserva la virulencia por largo tiempo; algunas publicaciones refieren que L. interrogans se mantiene virulenta mediante pases por animales susceptibles,3,14 y en el caso específico de las cepas de confrontación, el día del ensayo se recuperan los gérmenes de macerados de hígado de animales moribundos con los que se preparan las suspensiones para retar a los animales inmunizados.14 Este método es muy laborioso y no permite un buen control del inóculo. Otras referencias no especifican cómo se deben conservar las cepas de reto virulentas.9,10,15El segundo parámetro en importancia se relaciona con el cultivo: medio, edad y condiciones en que debe mantenerse hasta el momento de ser utilizado. El tercero se refiere al ajuste de la suspensión a partir de la cual se preparan las diluciones seriadas que reciben los animales. Se reporta el uso de la cámara de Petroff-Hausser para realizar el conteo del número de leptospiras presentes en el cultivo de partida,10 en ese caso la DL50 se expresa en leptospiras por dosis inoculada, valor que se toma después para preparar los inóculos de reto de modo que contengan de 10 a 10 000 DL50.El cuarto parámetro se relaciona con la especie animal que se va a utilizar, la cantidad y el peso; a veces el sexo también es importante. El quinto tiene que ver con la dosis y la vía de administración del inóculo, el sexto con las condiciones en que deben mantenerse los animales y el séptimo con el tiempo de observación de éstos.Si se procura que estas condiciones se repitan para cada ensayo, entonces la variación en los resultados será menor y mayor la reproducibilidad, por lo que se garantizará el éxito de la prueba.En el presente trabajo se describe la metodología utilizada para normalizar la DL50 de las cepas de L. interrogans serogrupos canicola, icterohaemorrhagiae y pomona que intervienen en el ensayo de potencia de la vacuna antileptospirósica trivalente cubana (vax-SPIRAL), de acuerdo con los parámetros señalados.MÉ

[学科分类] 传染病学