PCR-RFLP/Hsp70 for identification and tipification of Leishmania from the tropical region

[摘要] Se realizó la estandarización de las condiciones de amplificación del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de Leishmania mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Hsp70), así como el análisis posterior de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del producto amplificado, utilizando como molde ADN puro de una cepa de referencia de Leishmania mexicana. Se estudió la sensibilidad y especificidad analíticas de la PCR, así como la reproducibilidad, utilizando ADN de L. mexicana, L. amazonensis, L. guyanensis y L. lainsoni. Se obtuvo una banda de 1,3 Kpb, demostrándose la amplificación del gen que codifica para la Hsp70. Los patrones de bandas obtenidos tras la digestión enzimática, utilizando la enzima Hae III, permitieron establecer diferencias entre las especies estudiadas: L. guyanensis y L. lainsoni se diferencian entre sí y estas a su vez de L. mexicana y L. amazonensis, que mostraron un patrón de bandas común. La sensibilidad y especificidad analíticas de la técnica fueron adecuadas. Se demostró la factibilidad de identificar y tipificar especies del continente americano mediante la PCR-RFLP/Hsp70, y de utilizar la restricción enzimática del producto amplificado para distinguir entre Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi, dándose un primer paso en el establecimiento de estos métodos moleculares en el laboratorio de referencia del instituto. Palabras clave: PCR-RFLP, Leishmania, Hsp70, identificación, optimización.   El género Leishmania comprende protozoos parásitos pertenecientes a la Familia Trypanosomatidae, hemoflagelados y diploides, que son responsables de un conjunto de enfermedades conocidas como leishmaniosis.1 Diferentes formas clínicas de esta parasitosis pueden presentarse, en estrecha relación con la especie de Leishmania involucrada y la respuesta que resulta del equilibrio entre la inmunidad celular y humoral.2 La importante diversidad fenotípica de Leishmania ha ocasionado una compleja taxonomía con más de 20 especies descritas,3 la mayoría en América Latina. Dada la complejidad epidemiológica de algunas de sus regiones, con una distribución muy heterogénea de parásitos, los ciclos de transmisión de las diferentes especies pueden superponerse y varias especies pueden encontrarse en un mismo foco.4 Además, la intensa migración humana, así como el turismo, pueden llevar a la dispersión de Leishmania más allá de su distribución ecológica tradicional,5 todo lo cual justifica la necesidad de tipificar las especies infectantes. Diversos métodos de caracterización se han aplicado al estudio de este género, como la electroforesis de isoenzimas,6 el análisis del ADN del kinetoplasto (ADNk),7 la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD)8,9 y el cariotipaje molecular.10 En los últimos años, la reacción en cadena de la polimerasa, seguida de la restricción del producto amplificado (PCR-RFLP) se ha erigido en una importante herramienta, no solo para la identificación, sino para la caracterización de especies de este género, en distintas zonas geográficas.11-13 Recientemente, García y otros14 reportaron la utilidad de la amplificación y posterior digestión del producto del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 70 kD de Leishmania (Hsp70), para identificar varias especies del Nuevo Mundo, demostrando su aplicabilidad al estudio de muestras clínicas. Tomando en cuenta estos antecedentes, los autores de este trabajo se propusieron optimizar en las condiciones cubanas, la PCR-RFLP/Hsp70, utilizando ADN puro de una cepa de referencia de Leishmania mexicana, así como estudiar la sensibilidad y especificidad analíticas de la técnica y su reproducibilidad, utilizando ADN de otras 3 especies de la región latinoamericana, con el fin de verificar su utilidad en nuestras condiciones, como paso fundamental en la implementación de técnicas moleculares útiles para la tipificación de especies de este parásito. Mé

[学科分类] 传染病学

[关键词] : PCR-RFLP;Leishmania;Hsp70;identification;optimization