Evaluation of the transcription of locus rfb for the biosynthesis of LPS in Leptospira interrogans subtype hardjoprajitno

[摘要] Se construyó el plásmido pGL4W15-96 a partir del vector sin promotor para kanamicina pGL4W74 y una secuencia de 480pb que contenía al supuesto promotor J15, con el objetivo de confirmar el papel de la secuencia J15 como promotor para Leptospira; el cual restauró la transcripción del gen de resistencia a kanamicina en Escherichia coli y Leptospira biflexa, confirmando así la función del inserto como promotor para ambos organismos. Palabras clave: Leptospira, LPS, promotor, plásmido.  Además de ser antigénicamente indistinguibles, los 2 subtipos de la serovariedad hardjo: hardjobovis y hardjoprajitno tienen una organización genética similar en sus loci rfb.1-9 La presencia de transposasas similares a la familia IS5 entre los marcos de lectura abiertos H14 (polimerasa del antígeno O) y H15 (flipasa) en hardjobovis, anticipaba la transcripción del locus rfb en 2 unidades. Esto fue confirmado por RT-PCR.2 En contraste, hardjoprajitno tiene una región intergénica J14 - J15 de longitud similar a su homólogo en hardjobovis pero sin transposasas. Análisis de transcripción por RT-PCR revelaron una sola unidad de transcripción en hardjoprajitno desde J1 hasta J31. Análisis más detallados mediante extensión del iniciador (PE) demostraron un sitio de inicio de la transcripción asociado con secuencias similares a promotores s70 de E. coli arriba de J15 en hardjoprajitno.1, 8 Para confirmar el papel de esas secuencias como promotores para Leptospira, se construyó un vector sin promotor para kanamicina, pGL4W74 utilizando como base el vector pGKLep4.7 Un fragmento doble Sau3AI de 480 bp que contenía el supuesto promotor arriba de J15, fue clonado en pGL4W74. La E. coli que contenía el plásmido recombinante, pGL4W15-96, fue cultivada en caldo LB con 0, 5, 10, 25, 50, 100 y 250 mg/mL de kanamicina en agitación a temperaturas de 25, 30, 37 y 42 °C. Se midió la OD600 por triplicado a las 0, 1, 2, 3 y 24 h y cada ensayo fue también repetido por triplicado. El constructo, pGL4W15-96, restauró la transcripción del gen de resistencia a kanamicina, lo que resultó en colonias KaR de E. coli y Leptospira biflexa, confirmando así, la función del inserto como promotor para ambos organismos. E. coli recombinantes mostraron una absorvancia de hasta 1,7 en todas las concentraciones de kanamicina a 30 y 37 °C; pero absorvancias tan bajas como 0 a 25 y 42 °C en concentraciones de 50 mg/mL de kanamicina. La transcripción de los loci rfb de ambos subtipos de la serovariedad hardjo en 2 unidades está conservada a pesar de las diferencias estructurales en sus regiones intergénicas orf14-orf15. La transcripción regulada por el fragmento de 480 bp de esta región intergénica en hardjoprajitno, es dependiente de temperatura, siendo activa a 30 y 37 °C, pero no activa a 25 ni 42 °C.   Evaluation of the transcription of locus rfb for the biosynthesis of LPS in Leptospira interrogans subtype hardjoprajitno

[学科分类] 传染病学

[关键词] : Leptsopira;LPS;promoter;plasmid