Study of the genetical stability of the system of expression of protein E of dengue virus 4 in methyltrophic yeast Pichia pastoris

[摘要] Se realizó el análisis de la estabilidad plasmídica de la levadura metilotrófica Pichia pastoris que expresa la proteína recombinante E del virus dengue 4. Para ello se estimó el número de generaciones desde el proceso de crecimiento en placa petri hasta la propagación en zaranda, así como el proceso de fermentación. Además se determinó en las colonias seleccionadas  el patrón de integración por Dot-Blot y secuencia nucleotídica del gen E del virus dengue 4. Este estudio permitió comprobar la conservación e integridad de la secuencia aminoacídica de la proteína E, a pesar de encontrarse cambios genéticos producidos por mecanismos moleculares de la levadura; por otra parte, formó parte del control y chequeo realizado al banco de células primario de levadura que contiene el gen de interés, actualmente utilizado en el proceso de expresión de la proteína E del virus dengue 4.Palabras clave: Levadura Pichia pastoris, banco de células primario, ADN recombinante, virus del dengue 4.   La idea de convertir células vivas en fábricas microscópicas para la producción de alimentos, enzimas y productos farmacéuticos fue planteada a inicios de la década de los ochenta por muchos investigadores y ya en los años 90 emergieron con gran fuerza sistemas de expresión de genes recombinantes en bacteria, levaduras y células mamíferas como métodos de producción para importantes productos.La calidad de un banco de células usado para inocular un cultivo a gran escala es uno de los parámetros más importantes a tener en cuenta en el proceso de producción, porque este afecta directamente la calidad del producto final.1 Para asegurar esto es necesario monitorear el estado del sistema de expresión del DNA recombinante, así como demostrar que el cultivo se mantiene puro y las células estables en el proceso de producción final.  El análisis de la estabilidad genética de las células de un banco es imprescindible para determinar que la secuencia que codifica para el producto final es correcta y se mantiene en las células hasta el final del proceso.2 Mutaciones al nivel de la secuencia genética producidas por las células pueden ser incorporadas y mantenidas, dando como resultado final una proteína cuyas características pueden ser adversas en su utilización posterior (International Conference on Harmonization: Final Guideline on Quality of Biotechnological Products: Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of rDNA-Derived Protein Products. ICH Secretariat, Geneva, Switzerland, February 1996). En el presente trabajo se realizó la comprobación de la estabilidad y calidad genética de un banco de células  de la levadura metilotrófica Pichia pastoris,  como sistema de expresión para la proteína E del virus dengue 4, a partir del cual se desarrollaron estrategias para la obtención de un candidato vacunal.3 Esta proteína se obtiene de forma recombinante por un proceso de fermentación de la cepa MP36 mutante en el gen HIS3, a la cual se le incorporó por recombinación homóloga el gen que codifica para la proteína E del virus dengue 4 contenido en el vector de integración pFAO.La integridad del marcador de selección, la detección del gen de la envoltura del virus dengue 4, así como su secuenciación y comparación con la secuencia original son los objetivos propuestos a desarrollar para determinar la influencia de un elevado número de generaciones en dicho sistema de expresión.Mé

[学科分类] 传染病学

[关键词] : Yeast Pichia pastoris;primary cell bank;recombinant DNA;dengue virus 4