Expression in Escherichia coli of the gspd l gene of the type II secretion system in Leptospira borgpetersenii serovariety hardjo

[摘要] Se clonó un fragmento de 1,539 pb del gen homólogo a gspD de hardjobovis en el vector pET28a y fue transformado en E. coli cepas C43 y Rosetta. La secuencia de GspDL mostró 46 % de similitud con la secretina GspD de E. coli. La expresión de GspDL recombinante fue lograda en la cepa Rosetta. Palabras clave: Leptospira, sistema de secreción, E. coli.   Leptospira borgpetersenii hardjo (Hardjobovis) produce infertilidad, agalactia y aborto en bovinos así como infección en humanos.1,2 El proteoma de la membrana externa de L. interrogans Lai sugirió 8 proteínas nuevas.3-7 La secuencia parcial de aminoácidos de una (pL18) mostró homología con GspG, una proteína del sistema de secreción tipo II (GSP) en E. coli.3,8 A partir del gen homólogo a gspD de Hardjobovis (3 marcos de lectura arriba de gspG) se amplificaron 1,539 pb. El fragmento, clonado en el vector pET28a, fue transformado en E. coli DE3 cepas: C43 y Rosetta. El plásmido recombinante pAL208 fue secuenciado para confirmación del constructo. E. coli recombinante fue cultivada con kanamicina (50 mg/mL) y glucosa (0,1 a 2 %) a 37 °C durante 1 h en agitación y entonces inducida con IPTG (0,5 a 10 mM) durante 3,5 h a 37 °C o temperatura ambiente. Los cultivos fueron sonicados y sus proteínas separadas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (12 %). Se realizó inmunodetección tipo Western con anticuerpos monoclonales anti-T7 y anti-histidina. La secuencia de GspDL mostró 46 % de similitud con la secretina GspD de E. coli. Analizando la secuencia nucleotídica, se observó que el uso de codones para arginina en L. borgpetersenii es: AGA–45,45 %; AGG–18,18 % y CGA–18,18 %; mientras que en E. coli es: AGA–3,9 %; AGG–2,2 % y CGA–3,9 %. La inmunodetección de GspDL fue negativa en la cepa C43. Se utilizó entonces la cepa Rosetta codon plus cultivada con 0,2 % de glucosa a 37 °C durante 50 min e inducida con 10 mM de IPTG durante 3,5 h en agitación, para lograr la expresión de GspDL recombinante (66,7 kDa). A los autores de este trabajo les interesaba entender el papel que desempeñan en Leptospira las proteínas del GSP, en particular su potencial como inmunógenos y maquinaria de secreción. La purificación de GspDL recombinante permitirá producir anticuerpos para ensayos de opsonofagocitosis de L. borgpetersenii y para corroborar la localización de GspDL sobre la superficie de Leptospira.   Expression in Escherichia coli of the gspdl gene of the type II secretion system in Leptospira borgpetersenii serovariety hardjo

[学科分类] 传染病学

[关键词] : Lepsotspira;secretion system;E