Evaluation of the genotoxic potential of Boerhavia erecta L.

[摘要] Se evaluó la actividad mutagénica de un extracto acuoso de follaje liofilizado de Boerhavia erectaL. Se emplearon 2 pruebas: de Ames e inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón. En el ensayo de Ames, los resultados fueron negativos en todas las cepas probadas de Salmonella typhimurium:TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100, con un protocolo de incorporación en placa y concentraciones hasta 5 mg de liofilizado/placa. En el ensayo de micronúcleos, se hicieron 2 administraciones orales a razón de 10 mL/kg, separadas 24 h, con sacrificio 24 h después de la última aplicación. Las dosis fueron 500, 1 000 y 2 000 mg de liofilizado/kg. No se observaron variaciones en la relación entre eritrocitos policromáticos y eritrocitos normocromáticos, indicador de toxicidad medular. Tampoco se encontraron alteraciones significativas en la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados entre los distintos grupos de tratamiento. Se comprobó que el extracto acuoso de follaje liofilizado de B. erectano parece inducir efectos mutagénicos en los 2 sistemas de ensayo donde se evaluó.Palabras clave: Boerhavia erectaL., test de Ames, test de micronúcleo, genotoxicidad.Boerhavia erectaL. de la familia Nictaginaceae, conocida en Cuba como tostón está ampliamente distribuida en América, Asia Oriental y en África Tropical, donde las decocciones de sus partes aéreas se usan tradicionalmente, como antiespasmódico y expectorante, para el tratamiento de la epilepsia, para la secreción biliar y las congestiones del hígado.1Otros efectos demostrados han sido: actividad antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica) y antiparasitaria, de raíces y semillas, en diferentes microorganismos. Se ha detectado actividad en los extractos etanólicos al 80 % contra la Entamoebahystolytica, in vitroe in vivo en ratas, en la amebiasis hepática y en especies de dermatofitos (Trichophotum mentagophytes).2-7Entre los compuestos encontrados en estudios fitoquímicos se destacan principalmente los alcaloides, retinoides y los flavonoides, además de aminoácidos, ácidos grasos insaturados, fitoecdisonas y lignonas, sin contar el alto contenido de minerales que poseen las especies de este género.8-14Como parte de las investigaciones farmacológicas y toxicológicas auspiciadas por el Programa Nacional de Plantas Medicinales, encaminado a fundamentar científicamente los usos tradicionales atribuidos a la flora cubana, se realizó este estudio para evaluar el potencial mutagénico de un extracto acuoso liofilizado de esta planta.MétodosSe emplearon 2 ensayos: la prueba de Ames, que detecta mutaciones génicas y el de micronúcleos, un ensayo ampliamente validado internacionalmente que evalúa daño genético causado por agentes clastogénicos y aneugénicos in vivo.Material vegetalLa planta se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales “Dr. Juan Tomás Roig”. Se colectó en mayo de 1999. Un ejemplar de la misma se conserva en el herbario de la institución con número ROIG 4642. El liofilizado se preparó con un extracto acuoso (relación material vegetal:solvente, 300 g:2400 mL) del follaje de la planta en el Laboratorio de Productos Naturales. La fecha de elaboración fue 29 de septiembre de 1999.Ensayo de AmesSe emplearon 4 cepas de Salmonella typhimurium,TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100, cortesía del Dr. Bruce N. Ames(Universidad de California en Berkeley, EE.UU.). Se empleó el método de incorporación en placa del extracto acuoso liofilizado de B. erectaen concentraciones de 50 a 5 000 mg de sólidos totales liofilizados/placa. El ensayo se realizó según protocolos bien estandarizados.15 Se probaron 5 concentraciones, mediante siembra de 3 placas por cada concentración en un experimento único. La prueba se realizó en presencia y ausencia de activación metabólica externa, provista por fracción S9 (4 %, concentración final) obtenida a partir de hígado de ratas tratadas con fenobarbital y 5,6 benzoflavona. Las placas se incubaron a 37oC y se contaron las colonias revertantes a las 48 h. Los resultados se analizaron utilizando el programa SALANAL versión 1.0 de la Environmental Protection Agency (EPA) EE.UU. Como criterios de genotoxicidad se asumieron: aumentos significativos y dosis dependientes en la frecuencia de revertantes.Ensayo de micronúcleosSe establecieron 5 grupos experimentales: control negativo (agua destilada), control positivo (ciclofosfamida, 20 mg/kg en dosis única 24 h antes del sacrificio) y 3 dosis de 500, 1 000 y 2 000 mg de sólido liofilizado/kg. Cada grupo contó con 10 animales, 5 de cada sexo. Se emplearon ratones suizos de la colonia del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM, con 5 semanas de nacidos y un peso de 20 a 23 g. El extracto se administró por vía oral a razón de 10 mL/kg, en 2 dosis separadas 24 h y se procedió al sacrificio 24 h después de la última aplicación.Los animales se sacrificaron por dislocación cervical. Las muestras de médula ósea se obtuvieron según lo establecido.16,17 Estas se fijaron con etanol al 95 % (v/v) durante 5 min y secadas al aire durante 24 h. Finalmente se tiñeron con Giemsa al 5 % (v/v) en buffer fosfato pH 6,8 durante 20 min aproximadamente.Se contaron al menos 2 000 eritrocitos policromáticos (PCE) por animal y además, los eritrocitos normocromáticos (NCE) presentes por 250 PCE para estimar la relación PCE/NCE, indicador de citotoxicidad medular.Para el procesamiento estadístico de los datos, se normalizaron los valores de PCE/NCE y el porcentaje de PCE micronucleados (MNPCE) para cada animal empleando la transformación Ö(x + 1). Después se procedió a realizar un análisis de varianza de una vía considerando los tratamientos. Las comparaciones individuales se realizaron utilizando la prueba t de Student.Como criterios de genotoxicidad se asumió: la existencia de incrementos significativos en la frecuencia de PCE micronucleados así como el que estos aumentos estuvieran directamente relacionados con las dosis administradas (relación dosis-respuesta).ResultadosLa tabla 1 resume los resultados del ensayo de Ames. Como puede observarse, no hubo incremento dosis dependiente de la frecuencia de revertantes por colonia para ninguna de las cepas de Salmonellaensayadas, que es el indicador de mutagenicidad para esta prueba, para concentraciones de hasta 5 mg/placa, valor que se acepta como límite superior de exposición en ausencia de toxicidad o de problemas de solubilización.18Tabla 1.Ensayo de Ames en Salmonella typhimurium para el extracto acuoso liofilizado de B. erectaConcentración µg/placa Colonias revertantes/placa ± DS   TA-98 TA-100   (+S9) (-S9 ) (+S9) (-S9 ) 0a 22,67 ± 4,73 19,00 ± 4,36109,00 ± 4, 111,33 ± 8,08 50 24,33 ± 5,51 18,00 ± 1,73 108,33 ± 28,33 110,00 ± 0,58150 24,00 ± 8,54 20,00 ± 5,20 88,00 ± 30,79 112,68 ± 7,51500 21,33 ± 4,04 29,33 ± 3,06 123,00 ± 15,52 107,67 ± 5,95 1 500 33,33 ± 6,44 35,67 ± 20,6081,00 ± 22,61 108,67 ± 7,57 5 000 26,67 ± 5,03 19,33 ± 5,77 138,67 ± 16,20 115,00 ± 1,66 Control positivo1 3 100,00 ± 100,00 1 600,00 ± 41,42 600,00 ± 40,00 791,00 ± 0,40 Concentración µg/placaColonias revertantes/placa ± DS    TA-1535 TA-1537   (+S9) (-S9 ) (+S9) (-S9 ) 0a 9,67 ± 1,53 5,00 ± 3,00 13,67 ± 3,06 12,00 ± 5,57 50 7,33 ± 2,52 8,00 ± 1,0020,33 ± 7,51 14,00 ± 1,00 150 13,00 ± 6,68 14,00 ± 6,0014,33 ± 6,11 16,33 ± 3,21 500 11,33 ± 0,58 10,67 ± 2,52 11,67 ± 1,53 17,33 ± 2,08 1500 9,00 ± 2,00 3,67 ± 0,5814,00 ± 2,00 16,00 ± 4,36 5000 9,33 ± 2,31 11,87 ± 7,02 16,33 ± 5,86 15,33 ± 6,35 Control positivo1 167,33 ± 66,01 725,33 ± 60,57386,00 ± 33,28 500,00 ± 50,00 1Controles positivos: S9: azida de sodio, 1,5 mg/placa para las cepas TA 1535 y TA 100, ácido picrolónico: 100 mg/placa para la cepa TA 98, ICR 170: 10 mg/placa para la cepa TA 1537, cepas TA 1537, TA 98, benzo (α) pireno: para la cepa TA 100, ciclosfosfamida: 500 mg/placa para la cepa TA 1535.En el ensayo in vivo,prueba de micronúcleos, las tablas 2 y 3 muestran que no se observan diferencias entre control y dosis para la relación PCE/NCE ni el valor de MNPCE/1000PCE.Tabla 2. Resultados del ensayo de micronúcleos en ratones machos tratados con extracto de B. erectaTratamiento (mg/kg) PCE/NCE ± DS % MNPCE ± DS Controles     Agua destilada 1,82 ± 0,11 1,00 ± 0,61 Ciclofosfamida, 20 mg/kg 2,83 ± 0,32 33,10 ± 9,55** Extracto de B. erecta     500 4,29 ± 1,88 0,80 ± 0,75 1000 2,15 ± 0,71 0,90 ± 0,54 2000 2,49 ± 0,84 1,50 ± 0,50 ** p< 0,01Tabla 3. Resultados del ensayo de micronúcleos en ratones hembras tratados con extracto de B. erectaTratamiento (mg/kg) PCE/NCE ± DS % MNPCE ± DS Controles     Agua destilada 1,74 ± 0,04 1,30 ± 0,57 Ciclofosfamida, 20 mg/kg 2,80 ± 0,35 31,9 ± 9,37** Extracto de B. erecta     500 1,44 ± 0,70 0,90 ± 0,41 1 000 1,76 ± 0,48 1,40 ± 0,42 2 000 3,29 ± 1,88 1,87 ± 0,85 ** p <0,01DiscusiónTal como puede observarse a partir de los resultados, el liofilizado del extracto acuoso de B. erectaestudiado no parece inducir efectos mutagénicos en los 2 sistemas de ensayo donde se evaluó.Entre los componentes químicos del follaje de esta planta, se encuentran algunos pertenecientes a familias químicas que han sido registradas como antimutagénicas, entre ellos, los flavonoides, que pueden haber influido en que la respuesta haya sido negativa al antagonizar cualquier efecto genotóxico que pudiera inducir algún otro compuesto presente en el extracto, situación muy común en la mayoría de las especies vegetales y que contribuye a fundamentar la inocuidad de su uso en la medicina tradicional.

[学科分类] 药理学