Chemical constituents from roots of Pyrostegia venusta and considerations about its medicinal importance

[摘要]

[学科分类] 化学（综合）

[关键词] Pyrostegia venusta;Bignoniaceae;allantoin;steroids;hesperedin.   INTRODUÇÃO O gênero Pyrostegia Presl.;família Bignoniaceae;é representado na América do Sul tropical por um máximo de quatro espécies. A espécie Pyrostegia venusta (Ker.) Miers (sinonímia Pyrostegia ignea e Bignonia venusta);conhecida popularmente como cipó ou flor de São João;é uma liana trepadeira com expressiva dispersão em quase todo o sul do Brasil;sendo encontrada nas orlas das matas;nos campos;no litoral e na beira das estradas1. Esta planta é invasora de pastos;onde foram registrados casos de envenenamento de bovinos após a sua ingestão2. As suas flores são utilizadas na medicina popular para tratamento de manchas brancas no corpo (leucoderma;vitiligo)3. O caule é utilizado como tônico;antidiarréico e na confecção de cestos. Trata-se de uma planta ornamental que se multiplica rapidamente;servindo para revestir muros e caramanchões. A literatura não registra estudo químico das raízes de Pyrostegia venusta;encontrando-se relatados estudos fitoquímicos das flores e do caule. Estudos do néctar das flores conduziram ao isolamento de aminoácidos e de açucares4;5. Das flores foram isolados b-sitosterol;n-hentriacontano (n-C31H64);7-O-b-D-glicopiranosilacacetina e meso-inositol (myo-inositol)6. Um artigo avaliando o estudo de 40 espécies de Bignoniaceae;entre elas a Pyrostegia venusta;revelou resultados uniformes e compatíveis com a presença de fenóis livres e grupos siringila7. O padrão floral contendo antocianinas exibe pequena variação nas plantas da família Bignoniaceae8. Duas teses de Mestrado descreveram resultados sobre o padrão de floração associado à biologia e reprodução1 e palinológicos (estudo do polén)9 da espécie Pyrostegia venusta. O estudo químico das raízes de Pyrostegia venusta foi desenvolvido em continuidade à investigação fitoquímica que vem sendo realizada com a família Bignoniaceae. O extrato etanólico das raízes forneceu quatro substâncias;que foram identificadas com base na interpretação de dados espectrais;principalmente RMN1H e 13C;como alantoína (1);os esteróides b-sitosterol (2) e 3b-O-b-D-glicopiranosilsitosterol (3) e a flavanona hesperidina (4). Os dados de RMN uni- (1D) e bidimensional (2D) do derivado peracetilado 4a foram usados para a confirmação estrutural;atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio (dH) e carbono (dC). Assim;RESULTADOS E DISCUSSÃO A alantoína (1) foi isolada de precipitado fornecido pelo extrato bruto e das frações cromatográficas 607;614;629 e 631 eluidas com CH2Cl2-AcOEt (2:8). Este constituinte foi identificado com base nos dados espectrais (DMSO-d6) de RMN1H e 13C comparados com valores descritos na literatura10. O espectro de RMN1H revelou três singlêtos largos correspondentes aos grupos HN-1 (dH 10;54);HN-3 (dH 8;05) e H2N-8 (dH 5;82) e dois sinais duplos (J=8;1 Hz) em dH 6;91 e 5;21 representantes dos hidrogênios HN-6 e H-5;respectivamente. O espectro bidimensional (2D) de correlação homonuclear 1Hx1H-COSY apresentou picos transversais correspondentes aos acoplamentos vicinais entre H-5 e HN-6 e tipo W entre H-5 e HN-3;em acordo com uma conformação inserindo estes átomos de hidrogênio num mesmo plano (1). A ausência de pico correspondente à interação spin-spin de H-5 (dH 5;21) e HN-1 (dH 10;54) sugere conformação mantendo ângulo diedro em torno de 90o entre estes átomos de hidrogênio;já que parece improvável a existência de troca química do hidrogênio do HN-1 (ponte de hidrogênio intramolecular com o átomo de oxigênio do grupo carbonílico localizado no carbono C-7) no solvente utilizado (DMSO-d6;ainda sem H2O);como evidenciado pela interação do HN-6 (sem troca química) e H-5 (Vide supra). O espectro de RMN13C apresentou três sinais correspondentes a átomos de carbono dos grupos carbonílicos C-2 (dC 157;7);C-4 (dC 173;4) e C-7 (dC 156;7) e um de carbono metínico em dC 62;65 atribuído ao CH-5. Estes dados espectrais revelaram-se em pleno acordo com valores descritos na literatura10. O b-sitosterol (2) foi isolado da fração cromatográfica 33-46 eluida com hexano. A identificação deste esteróide foi realizada por comparação direta com amostra autêntica. A fração cromatográfica 486 eluida com CH2Cl2 forneceu o 3b-O-b-D-glicopiranosilsitosterol (3);que foi caracterizado com base nos dados espectrais de RMN1H e RMN13C;envolvendo principalmente a comparação dos dC dos átomos de carbono com valores descritos na literatura11. A flavanona hesperidina (4;7-O-b-D-rutinosil-3';5-diidroxi-4'-metoxiflavanona) foi isolada pura (menor quantidade;fração 622) e em uma mistura com alantoína (1). A estrutura deste flavonóide foi identificada com base nos dados fornecidos pelos espectros de RMN1H e 13C (PND e DEPT). A confirmação desta estrutura foi obtida através de comparação dos deslocamentos químicos com valores descritos na literatura para os átomos de hidrogênio12 e carbono13 (Tabela 1);após a superação de obstáculos produzidos pela existência na literatura de estrutura errada usando o nome correto (Vide infra). Esta situação encontrada na literatura conduziu-nos para uma análise espectral mais detalhada e exigiu a preparação do derivado peracetilado 4a para confirmação estrutural. A presença do anel A 5;7-dioxigenado foi reconhecida pelos dois singletos largos em dH 6;05 (H-6) e 6;91 (H-8) revelados pelo espectro de RMN1H de 4 em DMSO-d6. O sinal do grupo metoxila foi observado em dH 3;85 (s). Os sinais em dH 4;50 (s) e 4;98 (d;J=8;0 Hz) foram atribuidos aos hidrogênios anoméricos H-1''' e H-1'';respectivamente. O sinal múltiplo entre dH 6;95 - 6;75 foi correlacionado com os hidrogênios aromáticos H-2';H-5' e H-6';sugerindo anel B 3'-hidroxi-4'-metoxi- ou 4'-hidroxi-3'-metoxi-. Outros sinais observados no espectro foram correlacionados com HO-3' (dH 9;10);HO-5 (dH 12;00;hidroxila quelatogênica);H-2 (dH 5;50;dl;J=9;0 Hz);2H-3 (dH 2;50 - 2;90;m);3H-6''' (dH 1;10;d;J=6;8 Hz) e os demais hidrogênios carbinólicos da unidade glucosídica entre dH 3;20 - 3;90. A principal dificuldade enfrentada para caracterizar a estrutura deste flavonóide glucosilado;utilizando principalmente os dados de RMN13C (Tabela 1);envolveu a confirmação dos grupos hidroxílicos e metoxílicos nos átomos de carbono C-3' e C-4';podendo a aglicona correspondente ser caracterizada hesperetina (5;3';5;7-triidroxi-4'-metoxiflavanona) ou seu isômero homoeriodictiol (6;4';5;7-triidroxi-3'-metoxiflavanona). A comparação dos dC (em DMSO-d6) dos átomos de carbono quaternários C-1' (dC 131;0);C-3' (dC 146;1) e C-4' (dC 148;0) e metínicos CH-2' (dC 114;2);CH-5' (dC 112;0) e CH-6' (dC 118;0) da flavanona glucosídica (Tabela 1) isolada de Pyrostegia venusta com dados descritos na literatura para a hesperidina13;14 revelou dados praticamente idênticos;sugerindo a mesma substância. No entanto;as estruturas incorporadas nas referências consultadas13;14 aparecem com anel B 4'-hidroxi-3'-metoxi- (em tabela contendo também o nome hesperedin13 ou a estrutura completa no próprio espectro14). Em outras palavras;os autores dos capítulos descritos nos livros citados13;14 utilizaram equivocadamente a unidade aglicônica homoeriodictiol (6) na estrutura da hesperedina;em desacordo com os dC C-1';CH-2';C-3';C-4';CH-5' e CH-6' compatíveis com os valores da aglicona hesperetina (5). Esta confusão foi esclarecida definitivamente após encontrar a estrutura correta da hesperidina (4)15;16 e das flavanonas hesperetina (5;3';5;7-triidroxi-4'-metoxiflavanona;aglicona da hesperidina) e homoeriodictiol (6;4';5;7-triidroxi-3'-metoxiflavanona);inclusive os dados de RMN13C registrados em DMSO-d6 como solvente14;o mesmo solvente utilizado para obtenção do espectro do flavonóide glicosilado isolado da Pyrostegia venusta. A comparação dos valores dos dC dos carbonos C-1';CH-2';C-3';C-4';CH-5' e CH-6' permite assegurar a distinção entre os dois padrões de substituição 3'-hidroxi-4'-metoxi- e 4'-hidroxi-3'-metoxi- do anel B;como revelam os valores descritos para as flavanonas 5 e 6 em DMSO-d6 (Tabela 1). Com base na posição ocupada pelo grupo metoxila (carbono C-3' ou 4') pode-se verificar modificações significativas nos valores dos dC dos sinais correspondentes aos átomos de carbono C-1';CH-2';C-3';C-4';CH-5' e CH-6' das flavanonas 5 e 6: i) desproteção (maior dC) nos carbonos ipso [DdC = 147;5 (6) - 146;7 (5) = 0;8 ppm no C-3' e DdC = 148;1 (5) - 146;9 (6) = 1;2 ppm no C-4';efeito b] e para [DdC = 131;4 (5) - 129;4 (6) = 2;0 ppm no C-1' e DdC = 119;6 (6) - 118;3 (5) = 1;3 ppm no CH-6';atenuação do efeito mesomérico protetor devido a maior eletronegatividade do carbono em relação ao hidrogênio] e proteção (menor dC;efeito g) nos carbonos localizados em posição orto [DdC = 112;1 (5) - 115;2 (6) = - 3;1 ppm no CH-5' e DdC = 111;1 (6) - 114;3 (5) = - 3;2 ppm no CH-2'];ii) as diferenças intramoleculares observadas entre os dC CH-2' e CH-5' de 5 [DdC = 114;1 (CH-2') - 112;1 (CH-5') = 2;0 ppm] e 6 [DdC = 115;2 (CH-5') - 111;1 (CH-2') = 4;1 ppm] e C-3' e C-4' de 5 [DdC = 148;1 (C-4') - 146;7 = 1;4 ppm] e 6 [DdC = 147;5 (C-3') - 146;9 (C-4') = 0;7 ppm]. Dados adicionais referentes aos dC destes átomos de carbono nas flavanonas 7;8 e 9 (Tabela 1);obtidos de espectros registrados em CDCl3 + MeOH-d4 (7) e CDCl3 (8 e 9);permitem confirmar a validade destas deduções e servem também para a avaliação de efeito de solventes.Os dados de RMN1H e 13C obtidos de espectros uni- (1D: RMN1H;RMN13C-HBBD e RMN13C-DEPT) e bidimensionais [2D: 1Hx1H-COSY;1Hx13C-HMQC-1J CH;1Hx13C-HMBC-nJ CH (n=2 e 3) e 1Hx1H-NOESY] do derivado peracetilado 4a;registrados em aparelho que trabalha a 500 MHz para 1H e 125 MHz para 13C;permitiram confirmar definitivamente a estrutura 4 para a flavanona isolada de Pyrostegia venusta (Tabelas 2 e 3). A comparação dos espectros de RMN13C-HBBD (Hydrogen Broad Band Decoupled) e RMN13C-DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) foram usados para reconhecer os sinais correspondentes a átomos de carbono quaternários;metínicos;metilênicos e metílicos (Tabela 2). O espectro 1Hx13C-HMQC-1J CH [interação spin-spin de hidrogênio e carbono através de uma (1JCH) ligação] foi utilizado para a atribuição dos dH e dC de carbonos hidrogenados e o 1Hx13C-HMBC-nJ CH [n=2 e 3;interação spin-spin de hidrogênio e carbono através de duas (2JCH) e três (3JCH) ligações] dos quaternários e confirmação de hidrogenados (Tabela 2). Os dC dos átomos de carbono CH-2' (dC 121;2);C-3' (dC 140;0);C-4' (dC 151;6);CH-5' (dC 112;5) e CH-6' (dC 124;9) de 4a (Tabela 2) caracterizaram a presença do grupo acetoxila no carbono C-3' (não em C-4');já que os dC dos átomos de carbono localizados em posição orto (CH-2' e C-4') e para (CH-6') revelam claramente a atenuação do efeito mesomérico doador de elétrons do grupo acetoxila;como revela a comparação com os dC destes carbonos em 4 (Tabela 1). O dC do carbono CH-5' (dC 112;5);meta em relação ao grupo acetoxílico;não revelou modificação significativa como previsto (Tabelas 1 e 2). O valor de J=11;1 Hz deduzido do sinal do H-2 (dH 5;41;dd;J=11;1 e 2;8 Hz) observado no espectro de RMN1H de 4a indica interação axial-axial e;consequentemente;pode-se postular a conformação 4b com H-2 em posição axial. O espectro 1Hx1H-NOESY de 4a (Tabela 3) revelou a interação espacial (dipolo-dipolo) dos hidrogênios metoxílicos MeO-4' (dH 3;81;s) e H-5' (dH 6;97;d;J=8;5 Hz);confirmando que mantêm entre si relação orto;a presença de picos transversais correspondentes às interações espaciais (NOE) do H-1'' (dH 5;13) com H-6 (dH 6;28) e H-8 (dH 6;44) confirmaram a presença da unidade b-D-glicopiranosila (H-1'' em posição axial;dH 5;13;d;J=6;7 Hz) no átomo de carbono C-7 e permitiu postular a existência das duas conformações mostradas em 4/4a (duas formas topoméricas médias com interconversão lenta na escala de tempo da RMN);que podem ser justificadas pela reduzida liberdade de rotação em torno da ligação entre o átomo de oxigênio do carbono C-7 e CH-1'' na temperatura e concentração usadas para registro do espectro;justificando-se também a presença de sinais correspondentes nas proximidades dos descritos na Tabela 2;a interação dipolar do hidrogênio H-1''' (dH 4;68) com os dois hidrogênios 2H-6'' (dH 3;80 e 3;60) confirmaram a localização da unidade a-L-ramnopiranosila no átomo de carbono CH2-6'' da unidade b-D-glicopiranosila;outras interações espaciais reveladas pelo espectro 1Hx1H-NOESY encontram-se resumidas também na Tabela 3. Com base no [a]D + 4;5 (c 1;76 em CHCl3) revelado pelo derivado acetilado 4a pode-se postular a configuração (-)-hesperedina (4) isolada de Pyrostegia venusta. Esta dedução baseou-se nos resultados de [a]D - 37;6 (c 1;8 em EtOH) para 5 e [a]D + 21;1 (c 1;28 em CHCl3) para seu derivado triacetilado16. Assim;a flavanona isolada de Pyrostegia venusta foi caracterizada definitivamente como (-)-hesperedina {4;7-O-rutinosil-3';5-diidroxi-4'-metoxiflavanona = 7-O-[a-L-ramnopiranosil (1® 6)-b-D-glicopiranosil]-3';5-diidroxi-4'-metoxiflavanona};substância natural já descrita na literatura (vide infra) e registrada pela primeira vez neste artigo como bioproduzida por espécie da família Bignoniaceae. Esta substância natural (4);[a]D - 47;3 (piridina)16;foi isolada de muitas espécies das famílias Rutaceae (e.g. Citrus spp e Roncinus trifoliata) e Labiatae (e.g. Mentha longifolia e Hussopus spp)15. Os flavonóides têm sido reconhecidos como responsáveis por atividade antialérgica;antiinflamatória;antiviral;antiproliferativa e anticarcerígena;além de afetar alguns aspectos do metabolismo de mamíferos17. Uma mistura de hesperetina (5) e homoeriodictiol (6);conhecida como citrin;revelou atividade vitamínica;sendo por isto denominada vitamina P durante algum tempo17. Algumas indústrias farmacêuticas utilizam flavonóides puros;inclusive hesperedina (4);isolados de citrus (citroflavonóides)18. Os resultados de estudo da relação estrutura - atividade de flavonóides como inibidores de xantina oxidase e eliminadores de superóxidos foram publicados recentemente19. O rendimento obtido de alantoína (6;89%);isolando-se 6;30 g de 91;44 g de extrato bruto;revelou-se significativo quando comparado com o produzido pelas raízes e folhas da espécie Symphtum officinale (Linn.). Esta espécie;conhecida como confrei;é muito utilizada como fitofármaco;contendo como um dos princípios ativos a alantoína (1) numa concentração de 0;6 a 0;8%20;rendimento muito menor do que o encontrado nas raízes de Pyrostegia venusta. A alantoína (1) possui atividade antiinflamatória;antipéptica;antipsioríase;antiúlcera;imunoestimulante e queratolítica;além de ser muito utilizada em dermatologia21;22. Assim;a quantidade de alantoína (1) isolada das raízes da Pyrostegia venusta permite sugerir esta espécie vegetal como fonte natural para comercialização desta substância;além de possibilitar outras investigações práticas e científicas. As raízes desta planta poderiam ser testadas e utilizadas no tratamento do vitiligo;além de oferecer oportunidade adicional para investigar o seu provável mecanismo de ação. O vitiligo é uma doença que ocorre com frequência significativa e permanece ainda com a causa precisa desconhecida;podendo ocorrer com a participação de fatores genéticos;imunológicos e neurais na sua etiopatogenia23. Essa enfermidade apresenta-se também associada à falta de melanina;substância dependente da presença de melanócitos funcionais nos seres humanos24. A (S)-alantoina (1);encontrada entre os metabólitos da Pyrostegia venusta;foi tambem isolada de Platamus orientalis16. O isolamento de 7-O-b-D glicopiranosilacacetina (10) e meso-inositol (11) das flores de Pyrostegia venusta6;também requer atenção especial dos pesquisadores envolvidos em investigações de atividade biológica de produtos naturais. A flavona acacetina;aglicona de 10;revelou atividade antiinflamatória;protetora capilar e espasmolítica16. Publicação relativamente recente17 relata a utilização clínica do meso-inositol (11) para minimizar neurite diabética e formação de catarata;sem revelar toxicidade. Investigações adicionais revelaram que esta substância natural também inibe a formação de adenoma (tumor geralmente benigno;formado pela proliferação dos elementos próprios de uma glândula) pulmonar em camundongas A/J17.  EXPERIMENTAL Procedimentos experimentais gerais. Os espectros de RMN1H (200 e 500 MHz) e de 13C (50 e 125 MHz) uni- (1D) e bidimensional (2D) foram obtidos nos espectrômetros Bruker AC-200 e Avance DRX 500 existentes;respectivamente;no Curso de Pós-graduação em Química Orgânica da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro;Seropédica;Rio de Janeiro;e no Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN);Universidade Federal do Ceará;Fortaleza;Ceará. Material vegetal. As raízes de Pyrostegia venusta foram coletadas por Celso Magri;na cidade de Cambé;Paraná;Brasil. A espécie foi identificada pela Professora Dra. M. C. Dias;Departamento de Biologia Animal e Vegetal da Universidade Estadual de Londrina;Londrina;Paraná;Brasil. Uma exsicata foi catalogada (FUEL - no 11599) e depositada no Herbário desse Departamento. Extração e isolamento de constituintes. As raízes (1;7 kg) foram secas em estufa (60o C);trituradas e submetidas a extração exaustiva com etanol 95 % na temperatura ambiente. O solvente foi destilado em evaporador rotatório sob vácuo;obtendo-se 91;44 g de resíduo. O resíduo (91;44 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel (274 g);utilizando-se hexano;misturas de hexano-CH2Cl2 com polaridades crescentes;CH2Cl2;misturas de CH2Cl2-AcOEt com polaridades crescentes;AcOEt;misturas de AcOEt-MeOH com polaridades crescentes e MeOH como eluentes. Foram coletadas 1500 frações de 500 mL cada uma. O b-sitosterol (2;0;50 g);p. f. 125oC;foi isolado das frações 33-46 eluídas com hexano. A fração 486;eluída com CH2Cl2-EtOAc(1:1);forneceu 3 (1;10 g). As frações 607;614 (eluídas com CH2Cl2-AcOEt;2:8);629 e 631 (eluídas com (AcOEt);forneceram a alantoína (1;6;30 g);p. f. 240oC. Da fração 622;eluída com AcOEt;foi isolada a hesperidina (4;1;03 g). A fração 623;eluida com AcOEt;forneceu uma mistura (1;02 g) contendo a alantoína (1) e a flavanona hesperidina (4). Derivado peracetilado 4a. O flavonóide 4 (20 mg) foi acetilado com anidrido acético (1;5 mL) na presença de piridina (1;5 mL) como usual para obter o derivado peracetilado 4a (18 mg);após filtração em coluna de sílica gel.  AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq;CAPES e PADCT/FINEP pelos auxílios e bolsas concedidas. Agradecemos também aos Professores Mário Geraldo de Carvalho;Curso de Pós-graduação em Química Orgânica da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro;Seropédica;Rio de Janeiro;e Edilberto Rocha Silveira;Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN);Universidade Federal do Ceará;Fortaleza;Ceará;pela obtenção dos espectros de RMN uni- (1D) e bidimensionais (2D) e à Professora Telma L. G. Lemos;Curso de Pós-graduação em Química Orgânica;Universidade Federal do Ceará;Fortaleza;Ceará;pela leitura da rotação ótica específica.  REFERÊNCIAS